正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)別離以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制實(shí)驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以確保實(shí)驗(yàn)成果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，闡明有非特異性反響，可選用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
實(shí)驗(yàn)條件的挑選
在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的挑選是很重要的，其間包括:
(1) 固相載體的挑選：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等?，F(xiàn)在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反響，調(diào)查其顯色反響是否均一性，據(jù)此判明其吸附功能是否杰出。
(2) 包被抗體(或抗原)的挑選：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)刻及其蛋白量也有必定影響,一般多選用4℃ 18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進(jìn)行包被后，在其它實(shí)驗(yàn)條件相同時(shí)，調(diào)查陽性標(biāo)本的OD值。挑選OD值z(mì)ui大而蛋白量zui少的濃度。對(duì)于大都蛋白質(zhì)來說一般為1～10μg/ml。
(3) 酶符號(hào)抗體作業(yè)濃度的挑選：首先用直接ELISA法進(jìn)行開始效價(jià)的滴定(見酶符號(hào)抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參閱品及酶符號(hào)抗體別離為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其作業(yè)濃度。
(4) 酶的底物及供氫體的挑選：對(duì)供氫體的挑選要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反響，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌效果，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是現(xiàn)在較為滿足的供氫體。底物效果一段時(shí)刻后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反響。一般底物效果時(shí)刻，以10-30分鐘為宜。底物使用液有必要新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前加入。